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　　美國(guó)E+E壓電生物傳感器臨床應(yīng)用
　　壓電生物傳感器是一種將高靈敏的壓電傳感器與特異的生物反應(yīng)結(jié)合在一起的新型生物分析方法 ,這一方法不需要任何標(biāo)記 ,且儀器構(gòu)造簡(jiǎn)單、操作方便 ,引起人們的濃厚興趣 ,逐漸成為生物傳感器領(lǐng)域中的一項(xiàng)研究熱點(diǎn)。本文就壓電免疫傳感器及壓電基因傳感器在微生物、蛋白質(zhì)及基因檢測(cè)等方面的研究應(yīng)用作一綜述。壓電生物傳感器將在分子生物學(xué)、疾病診斷和治療、新藥開(kāi)發(fā)、司法鑒定等領(lǐng)域具有很大開(kāi)發(fā)潛力。

　　美國(guó)E+E壓電生物傳感器臨床應(yīng)用
　　SNP （single nucleotide polymorphism,單核苷酸多態(tài)性）是指基因組特定位置上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的一種DNA序列多態(tài)性，如果人群中這種變異的頻率大于1%,即稱為SNP。作為基因變異的主要形式，SNPs在對(duì)疾病的起因、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和防治方面有著巨大的潛力。其研究已成為人類后基因組時(shí)代的主要內(nèi)容之一。近年大量研究證實(shí)，SNP位點(diǎn)不僅與一些人類疾病直接相關(guān)、還可以用來(lái)預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)藥物治療的應(yīng)答以及作為易患某種疾病的危險(xiǎn)人群的標(biāo)記，對(duì)疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和個(gè)性化醫(yī)療十分重要。因此，SNP的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于臨床診斷醫(yī)學(xué)具有重要的潛在意義，有望為臨床疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及個(gè)性化醫(yī)療診斷的研究開(kāi)辟新的切入點(diǎn)和研究焦點(diǎn)。 關(guān)于SNP的大量研究已經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)了很多和疾病相關(guān)的位點(diǎn)，但由于缺乏簡(jiǎn)單有效快速低廉的臨床檢測(cè)手段，SNP的研究還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，SNP潛在應(yīng)用價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有得到有效地挖掘。而壓電生物傳感器具有簡(jiǎn)單實(shí)用快速低廉的特點(diǎn)，如能將其應(yīng)用于SNP的檢測(cè)將具有廣闊的潛在臨床應(yīng)用前景。但SNP只有一個(gè)堿基的差異，SNP的檢測(cè)需要檢測(cè)方法能從樣本中分辨出只有一個(gè)堿基差異的目的序列。靶序列和干擾序列之間僅有一個(gè)堿基的差異，質(zhì)量變化小。這給基于質(zhì)量效應(yīng)原理的壓電生物檢測(cè)體系帶來(lái)挑戰(zhàn)，需要傳感器具有更高的敏感性和更好的特異性。因?yàn)楸狙芯繑M首先從多個(gè)方面提高壓電生物傳感器的穩(wěn)定性，然后通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)可以放大壓電生物傳感器的信號(hào)，提高其檢測(cè)敏感性。在此基礎(chǔ)上，建立高敏感的壓電SNP檢測(cè)方法。同時(shí)利用EIS方法對(duì)壓電SNP檢測(cè)體系進(jìn)行評(píng)估和驗(yàn)證，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。zui后，以慢性乙肝易感相關(guān)SNP位點(diǎn)為靶點(diǎn)，初步研究壓電SNP檢測(cè)方法在臨床標(biāo)本檢測(cè)中的應(yīng)用情況。 二、方法和結(jié)果 1.利用酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)建立高敏感的壓電傳感器SNP檢測(cè)方法： a.探討生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)用來(lái)放大壓電生物傳感器的檢測(cè)信號(hào)的可行性研究：分別固定標(biāo)記生物素和未標(biāo)記生物素的探針于壓電傳感器基片上，然后加入結(jié)合HRP的鏈親和素以及DAB底物，檢測(cè)分析頻率變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物素將HRP-SA結(jié)合到基片上后，后者催化DAB形成的不可溶沉淀緊密附著于壓電基片表面，引發(fā)諧振頻率顯著改變，zui低可檢測(cè)ssDN段10-13mol/l,而對(duì)照則無(wú)法檢測(cè)出有意義的頻率變化。表明酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)可以用于壓電傳感器，對(duì)發(fā)生在后者之上的生物反應(yīng)信號(hào)進(jìn)行放大，可以有效提高壓電傳感器的檢測(cè)敏感性。 b.利用酶生物信號(hào)放大系統(tǒng)，結(jié)合單堿基延伸技術(shù)，建立壓電生物傳感器的SNP檢測(cè)體系：分別合成兩條寡核苷酸，兩者間僅存在一個(gè)堿基的不同（A/G）；將其加入固定有未標(biāo)記探針的壓電檢測(cè)池，分別利用Taq、Pfu以及Klenow fragment三種不同的DNA聚合酶將biotin-dUTP延伸結(jié)合到探針上；zui后加入DAB,檢測(cè)頻率變化。結(jié)果表明含A堿基的序列能引起頻率的顯著變化，約20倍高于含G堿基的序列；單堿基延伸所采用的三種聚合酶中，pfu的特異性和敏感性。在模式試驗(yàn)中，本方法zui低可檢測(cè)出的zui低陽(yáng)性靶序列的濃度為2×10-11mol/l。與檢測(cè)普通雜交信號(hào)比較，采用放大系統(tǒng)后，信號(hào)檢測(cè)時(shí)間可縮短至20min,且結(jié)果穩(wěn)定性更好。 2. EIS系統(tǒng)的構(gòu)建及其應(yīng)用： 將壓電傳感單元、三電極系統(tǒng)和電化學(xué)工作站共同組成EIS檢測(cè)系統(tǒng)。設(shè)定適合分析壓電基片表面金膜的電化學(xué)參數(shù)，對(duì)空白時(shí)、探針固定后及雜交后金膜表面進(jìn)行了交流阻抗譜的檢測(cè)，根據(jù)阻抗值分析金膜表面生物學(xué)反應(yīng)情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)少部分實(shí)驗(yàn)用的壓電基片空白表面交流阻抗值異常，可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。探針固定和靶序列雜交的實(shí)驗(yàn)條件為：針對(duì)實(shí)驗(yàn)用的壓電基片金膜面積而言，zui適探針固定濃度為2μmol/l,zui適固定時(shí)間為60min,靶序列zui適雜交時(shí)間為60min。在壓電傳感器檢測(cè)SNP的每一步驟中，金膜表面交流阻抗值均有相應(yīng)變化。 3.壓電SNP檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用： 首先以慢性乙肝持續(xù)感染相關(guān)SNP位點(diǎn)（ESR1 T392C）為靶點(diǎn)，分析并建立適合該位點(diǎn)的SNP檢測(cè)探針、引物以及標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)體系。然后收集的臨床標(biāo)本，提取基因組DNA,并進(jìn)行特異性的擴(kuò)增。采用壓電SNP檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明該方法可以成功檢測(cè)出臨床來(lái)源標(biāo)本中的ESR1 T392C位點(diǎn)。隨后以經(jīng)典的RFLP方法為參照方法，以RFLP檢測(cè)的27例純合子為樣本，對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)壓電SNP檢測(cè)方法TT型檢出率為94.7%,CC型檢出率為87.5%。兩種方法經(jīng)x2檢驗(yàn)，p0.05,表明我們建立的SNP壓電檢測(cè)方法在臨床標(biāo)本的實(shí)際檢測(cè)中與RFLP相比具有較好的*性。 三、結(jié)論： 1.酶生物放大系統(tǒng)可以顯著增加壓電傳感器檢測(cè)DNA靶序列時(shí)的頻率變化，和干擾對(duì)照序列相比具有良好的特異性。表明酶生物放大系統(tǒng)有望作為一種特異、有效的放大手段應(yīng)用于壓電生物傳感器，在檢測(cè)微小質(zhì)量變化樣本中發(fā)揮重要作用。 2. EIS是一種有效的方法，可用來(lái)評(píng)價(jià)壓電生物傳感器，也可以用來(lái)優(yōu)化其檢測(cè)條件，其建立的實(shí)驗(yàn)條件符合壓電檢測(cè)實(shí)際情況，可用于壓電生物傳感器常規(guī)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)步驟和標(biāo)準(zhǔn)體系的建立。 3.建立了壓電SNP傳感器檢測(cè)慢性乙肝持續(xù)感染相關(guān)SNP位點(diǎn)（ESR1 T392C）的反應(yīng)體系，初步研究了其頻率變化特點(diǎn)；通過(guò)臨床標(biāo)本檢測(cè)，并和傳統(tǒng)方法RFLP對(duì)比分析，表明我們建立的SNP壓電檢測(cè)方法適合用于臨床標(biāo)本的實(shí)際檢測(cè)。

　　美國(guó)E+E壓電生物傳感器臨床應(yīng)用
　　近年來(lái)，壓電生物傳感器檢測(cè)技術(shù)逐漸成為生物分析中的研究熱點(diǎn)。它具有實(shí)時(shí)檢測(cè)、準(zhǔn)確定量、特異性高、無(wú)需標(biāo)記、經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是現(xiàn)代臨床診斷發(fā)展的一個(gè)新方向。其原理在于壓電晶體表面負(fù)載的質(zhì)量變化可通過(guò)自身諧振頻率變化反映出來(lái)，并通過(guò)固定不同識(shí)別元件，能夠檢測(cè)DNA、抗原-抗體、酶、細(xì)菌等多種物質(zhì)，在分子識(shí)別、臨床診斷、分子成膜過(guò)程、表面性質(zhì)、毒理研究等領(lǐng)域中已得到較為廣泛的應(yīng)用。同時(shí)壓電生物傳感器操作簡(jiǎn)便，環(huán)境要求簡(jiǎn)單，檢測(cè)設(shè)備易于微型化使其具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。